Os bacilos Gram-negativos multirresistentes são agentes etiológicos comuns de infecções associadas aos cuidados à saúde. O isolamento desses em ambientes hospitalares, casas de repouso, e em cenários na comunidade (ex. pacientes ambulatoriais, indivíduos hígidos, animais, e produtos alimentícios) também já foi descrito^1,4. A detecção precisa dos mecanismos de resistência contribui significativamente na condução terapêutica e no prognóstico dos pacientes ^2,3. Abaixo, apontamos os principais aspectos relacionados aos mecanismos de multirresistência e detecção laboratorial, com foco em enterobactérias^1,5. 

Beta-lactamase de espectro estendido (ESBL):  

Consiste em enzima que confere resistência à maioria dos beta-lactâmicos, incluindo penicilinas, cefalosporinas e ao aztreonam. Comumente, as infecções pelos microrganismos produtores de ESBL apresentam um pior prognóstico clínico. A maior parte das ESBL pertence à classe A de Ambler e apresenta inibição por inibidores de β-lactamase (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam) e por diazabiciclooctanonas (avibactam). As ESBL têm sido descritas exclusivamente em bactérias Gram-negativas, primeiramente em Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Escherichia coli, mas também em Acinetobacter, Burkholderia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia e Shigella spp. Os principais tipos de ESBL descritos são: 

• TEM: Beta-lactamases mediadas por plasmídeo que hidrolisam penicilinas e cefalosporinas de espectro estreito, como cefazolina e cefalotina.  No entanto, essas beta-lactamases não são capazes de hidrolisar cefalosporinas de terceira (Cefotaxima, ceftazidima e ceftriaxona) e quarta geração (Cefepima). São comuns em Enterobacterales, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae. Dentre os mais de 200 tipos já descritos, nem todos são ESBL. As TEM-1 e TEM-2 foram as primeiramente descritas, mas TEM-10, TEM-12, e TEM-26 consistem nos tipos mais frequentes descritos até hoje em todo o mundo; 

• SHV: Dentre os mais de 190 tipos descritos, SHV-2, SHV-5, SHV-7 e SHV-12 estão entre os mais comuns descritos até o momento no mundo. Conforme dito, consideramos ESBL as enzimas que conferem resistência à maioria dos beta-lactâmicos, incluindo penicilinas e cefalosporinas. Assim, as beta-lactamases que não exibem essa propriedade, não são consideradas ESBL. Nem todas as SHV são ESBL, mas aquelas com esse perfil consistem em beta-lactamases que hidrolisam as cefalosporinas de terceira geração adicionalmente às propriedades acima descritas para TEM; 

• CTX-M: Mecanismo de resistência enzimático mais frequente dentre os descritos, são caracterizadas por genes plasmidiais derivados originalmente de genes cromossômicos de espécies de Kluyvera. Apresentam maior atividade contra cefalosporinas de terceira e quarta gerações do que os tipos citados acima (TEM, SHV). Já foram descritas mais de 160 tipos, e são encontradas em enterobactérias como E. coli, K. pneumoniae e Salmonella spp. ; 

• OXA: Nem todas consistem em ESBL, mas aquelas que apresentam essas características são mediadas por plasmídeos que degradam também oxacilina e penicilinas anti-estafilocócicas. Algumas OXA também apresentam atividade de carbapenemase; 

• Outras famílias de ESBL mediadas por plasmídeos: As enzimas PER, VEB e GES já descritas em P. aeruginosa e degradam também cefalosporinas e monobactâmicos; enquanto BES, SFO e TLA foram descritas em enterobactérias.  

• Detecção laboratorial das ESBL 
  
  É baseada no padrão de resistência à cefalosporina de terceira e quarta gerações, e no potencial da ação do inibidor de beta-lactamase. As tipo AmpC são resistentes à inibição por clavulanato e comumente resistentes à cefoxitina, cefotetan e cefmetazol, diferentemente das ESBL. As tipo OXA são fracamente inibidas por clavulanato. Os métodos tradicionais para a detecção incluem: 
   
• Testes de triagem:  

1. Diluição em caldo ou ágar com concentração mínima inibitória (CIM) > 1 mg/L para cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima ou cefpodoxima. 
2. Método de disco-difusão com halo de inibição < 21 mm para cefotaxima (5 ug) ou cefpodoxima (10 ug), < 23 mm para ceftriaxona (30 ug), ou < 22 mm para ceftazidima (10 ug). 
3. Sistemas semi-automatizados (Vitek, MicroScan, and BD Diagnostics). 

• Testes confirmatórios: 

1. Teste do disco combinado (TDC). 
2. Teste de sinergismo do duplo disco (TSDD, cefalosporina de terceira ou quarta geração, próximo a um disco de clavulanato). 
3. Teste de gradiente para ESBL (Etest ESBL com clavulanato em uma extremidade, em um gradiente de cefalosporina). 
4. Teste de microdiluição em caldo com cefalosporina em diferentes concentrações e concentração fixa de clavulanato. 
5. Testes bioquímicos colorimétricos (ESBL NDP, 𝜷-LACTA). 
6. Métodos semi-automatizados: VITEK 2, Phoenix e Walkaway. 
7. Sequenciamento genômico ou microarranjo de DNA.  

Note que para confirmar ESBL em cepas que expressam alto nível de β-lactamases AmpC, é recomendada a realização de teste com cefepima, a qual não é hidrolisada por β-lactamases AmpC. Outra possibilidade é o uso de cloxacilina, um inibidor de enzimas AmpC.  

AmpC beta-lactamase 

Consiste em β-lactamase da classe C (serina) de Ambler com características de cefalosporinases que hidrolisam penicilinas, cefalosporinas (incluindo a terceira geração, porém geralmente não degradam os compostos de quarta geração) e também os monobactâmicos. Adicionalmente, as enzimas do tipo AmpC são fracamente inibidas pelos inibidores de ESBL clássicos, como o ácido clavulânico. Já foram descritas em grupos de espécies de Enterobacter (MIR, ACT), C. freundii (CMY-2 like LAT, FCE), M. morganii (DHA), Hafnia alvei (ACC), Aeromonas (CMY-1-like, FOX, MOX) e o grupo Acinetobacter baumannii (ABA). As principais produtoras de AmpCs adquiridas incluem E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella enterica e P. mirabilis. 

• Detecção laboratorial de AmpC 
  
  A CIM de cefoxitina >8 mg/L (zona de inibição < 19 mm) associada à resistência fenotípica a ceftazidima e/ou cefotaxima (de acordo com os pontos de corte) atendem aos critérios fenotípicos para a produção de AmpC em E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, Salmonella spp. e Shigella spp., apesar desta estratégia não detectar ACC-1, a qual não hidrolisa cefoxitina. A tipificação da AmpC pode ser caracterizada pela existência de sinergismo com cloxacilina e confirmada por estudos moleculares. É importante ressaltar que a resistência à cefoxitina pode adicionalmente ser associada à deficiência de porinas sendo sugerida pela ausência de sinergismo com cloxacilina. Nos laboratórios que realizam testes com cefoxitina, a sensibilidade à cefepima associada à resistência à cefotaxima e/ou ceftazidima é outro indicador fenotípico de AmpC, embora com menor especificidade.

• Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC): Enzima codificada por plasmídeo e já descrita em Escherichia coli, P. aeruginosa, Citrobacter, Salmonella, Serratia e Enterobacter spp. Outra enzima, BKC-1, já foi detectada em cepas K. pneumoniae no Brasil;  
• Beta-lactamases de Classe B: Os tipos já descritos incluem IMP, VIM, GIM, SPM e SIM, em diferentes espécies como: Aeromonas hydrophila, Chryseobacterium spp, Stenotrophomonas maltophilia, Serratia spp. , Klebsiella spp. , Pseudomonas spp. , Escherichia spp. , Acinetobacter spp. , Citrobacter spp. e Enterobacter spp. A enzima denominada New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM-1) também foi inicialmente descrita em K. pneumoniae e posteriormente em E. coli, Enterobacter cloacae e Acinetobacter, e em geral as cepas apresentam susceptibilidade apenas a colistina ou tigeciclina;  
• Beta-lactamases de Classe D: Também chamadas OXA-type, pela hidrólise de oxacilina. Já foram descritas em Acinetobacter baumannii, K. pneumoniae, E. coli, e E. cloacae. Dentre os >100 tipos descritos, seis subgrupos apresentam graus variáveis de hidrólise de carbapenêmicos: OXA-23, OXA-24/OXA-40, OXA-48, OXA-58, OXA-143, and OXA-51.  
   
• Detecção laboratorial - Testes fenotípicos:  

1. Triagem: Determinação da CIM (mg/L) >0,12 para meropenem e ertapenem ou método de difusão com discos de 10 ug de meropenem e ertapenem com diâmetro dos halos de < 28 e < 25 mm, respectivamente. 
2. Método de difusão com duplo disco (carbapenêmico e inibidor - disco combinado). 
3. Método de difusão com discos contendo carbapenêmico com ou sem inibidor. 
4. Teste Carba NP. 
5. Teste de gradiente E para a detecção de MBL. 
6. Método de inativação de carbapenêmico. 
7. Detecção de hidrólise de carbapenêmico por MALDI-TOF. 
8. Técnica de fluxo lateral - Anticorpos monoclonais para OXA-48-like. 

• Detecção laboratorial - Testes genotípicos: 

1. Reação de polimerização em cadeia (PCR) para genes específicos, incluindo PCR multiplex e tempo real. 
2. Plataforma comerciais: BDMax, Biofire, Cepheid, GeneXPert e CheckPoints; 
3. Micro Arranjos de DNA. 
4. Sequenciamento de genes específicos.  

Referências Bibliográficas: 
1. BrCAST - Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. http://brcast.org.br. Acesso em 01 de fevereiro de 2023.  
2. Bose P, Rangnekar A, Desikan P. NDM-beta-lactamase-1: Where do we stand? Indian J Med Res. 2022 Feb;155(2):243-252.  
3. Bush K, Bradford PA. Interplay between β-lactamases and new β-lactamase inhibitors. Nat Rev Microbiol. 2019 May;17(5):295-306. 
4. Tooke CL, Hinchliffe P, Bragginton EC, Colenso CK, Hirvonen VHA, Takebayashi Y, Spencer J. β-Lactamases and β-Lactamase Inhibitors in the 21st Century. J Mol Biol. 2019 Aug 23;431(18):3472-3500. 
5. Wilson H, Török ME. Extended-spectrum β-lactamase-producing and carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Microb Genom. 2018 Jul;4(7):e000197.  

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