Enterobacterales resistente aos carbapenêmicos (ERC)
 

O aumento crescente de ERCs tem sido relatado em vários cenários clínicos por todo o mundo. Esses agentes representam um grande problema de saúde pública, sobretudo, quando relacionados a infecções invasivas devido a limitação de opções para o tratamento, resultando no aumento das taxas de morbi-mortalidade.¹ 

A identificação da espécie bacteriana relacionada à infecção, bem como a realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos, são ferramentas importantes na otimização terapêutica. Entretanto, diante de uma ERC, é de grande importância epidemiológica saber se a resistência é mediada por betalactamases capazes de hidrolisar os carbapenêmicos (carbapenemases).²

Uma vez confirmada a presença de carbapenemase, torna-se necessário identificar o tipo de enzima envolvida para seleção do antimicrobiano adequado, uma vez que diferentes enzimas podem apresentar perfil de hidrólise dos carbapenêmicos semelhantes, porém respondem de forma diferente aos inibidores de betalactamases.³

Classificação das carbapenemases

Segundo Bush & Jacob (2020),⁴ as carbapenemases podem ser classificadas de acordo com a conformação molecular ou com a atividade fenotípica de hidrólise: 

• ​​​​​​Classe A - podemos destacar KPC, grupo de carbapenemases endêmico no Brasil e na maioria dos países da América Latina, principalmente as variantes KPC-2 e KPC-3, geralmente codificadas por genes localizados em plasmídeos. Exemplos de outras carbapenemases da classe A incluem alguns tipos de GES (GES-5), IMI/NMC-A (Enterobacter spp.) e SME (em Serratia spp.).^4,5

• Metalo-betalactamases (Classe B) - os grupos mais prevalentes dessa classe são NDM, VIM e IMP. Possuem zinco no sítio ativo, sendo inativadas por quelantes de metal, como o EDTA e o ácido dipicolínico. Outras carbapenemases da classe B incluem: AIM, GIM e SIM, além de SIM-1 e SPM- 1 descritas em P. aeruginosa.^4,5

• Oxacilinases (classe D) – as oxacilinases compreendem a segunda maior família de betalactamases, sendo que poucas detectadas em Enterobacterales, a exemplo da OXA-48, hidrolisam os carbapenêmicos.4 

Triagem para pesquisa de carbapenemases

Considerando os diferentes tipos de enzimas e a expressão heterogênea evidenciada pelos perfis de hidrólise dos carbapenêmicos, é importante ter em mente se o objetivo é a detecção de mecanismo de resistência ou avaliação da sensibilidade para fins terapêuticos. Há pontos de corte específicos para cada objetivo. No Brasil, os pontos de corte que devem ser utilizados, como critérios para fins terapêuticos ou para triagem de produção de carbapenemases, são aqueles definidos pelo BRCAST/EUCAST^7,8 (Tabela 1). 

Tabela 1. Pontos de corte clínicos e para triagem de Enterobacterales produtoras de carbapenemases.^7,8

1. A utilização de ertapenem tem maior sensibilidade, embora menor especificidade (isolados com ESBL e AmpC podem apresentar resistência mesmo sem ter carbapenemase), enquanto a utilização de meropenem aumenta a especificidade como triagem para na detecção de carbapenemases.

2. Isolados que apresentarem halo de inibição de meropenem entre 25-27 mm só necessitam ser investigados para produção de carbapenemases se forem resistentes a piperacilina/tazobactam e/ou temocilina (esta contribui mais para especificidade). Investigação de carbapenemases é sempre necessária se o diâmetro do halo para meropenem for < 25 mm.

Fonte: adaptado de European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST/ Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – BrCAST. Orientações do EUCAST para a detecção de mecanismos de resistência e resistências específicas de importância clínica e/ou epidemiológica. Versão 2.0, julho 2017.⁷

Deste modo, fica evidente o grande desafio dos laboratórios de análises clínicas para pesquisar carbapenemases em todos os isolados ao considerarmos os pontos de corte de triagem.^9,10

Métodos mais utilizados para detecção de carbapenemases nos laboratórios clínicos

Devido à grande variedade de métodos disponíveis, cada laboratório precisa avaliar as suas necessidades com relação à epidemiologia local, a sensibilidade e especificidade de cada método, o tipo de resposta que o teste fornece (se caracteriza apenas a hidrólise do carbapenêmico, ou se determina o tipo de enzima), o custo do teste, o tempo necessário para realização do ensaio e a leitura, a facilidade de execução, além da logística da rotina (destaca-se aqui o número médio de testes/dia).^9,11 

Esses testes são úteis para detecção da atividade de carbapenemase, e algumas variações permitem diferenciar entre as enzimas da classe A (em que a enzima representante mais comumente identificada é a Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC) e da classe B (que incluem as enzimas que utilizam o zinco como cofator por exemplo: NDM, IMP, VIM, entre outras).¹⁰

Métodos baseados na inativação do carbapenêmico (zCIM e mCIMplus) - Desde a publicação original de van der Zwaluw e colaboradores²⁰, diversas modificações foram propostas. Como a detecção de metalo-betalactamases (MBL) é um aspecto crítico para avaliar a epidemiologia da resistência à ceftazidima-avibactam, o método mais sensível publicado até o momento é o zCIM. Nesta variação do método original, o sulfato de zinco é adicionado para uma concentração final de 1,5 mM, aumentando em 16% a sensibilidade para metalo-betalactamases do tipo VIM, mas requer 18 horas de incubação. Na prática, uma alça cheia de 10 µL de crescimento bacteriano recente é suspendida em 400 microlitros de caldo (TSB) suplementado com 6,0 µL de EDTA 0,1M. A seguir adiciona-se um disco de meropenem de 10 µg e a incubação é realizada a 35 ± 2ºC por 2 horas. Após esta etapa, o disco de meropenem, exposto à suspensão bacteriana testada, é aplicado sobre a superfície de uma placa de ágar Mueller-Hinton previamente inoculada com uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 com turbidez MF 0,5. Após 18 horas de incubação, o diâmetro do halo eventualmente presente é aferido. Valores ≤ 20 mm indicam presença de carbapenemase, enquanto aqueles com diâmetro > 20 mm indicam teste negativo.²¹ 

O método mCIMplus é uma modificação do método original que permite a primeira leitura após 8 horas de incubação e caracterização do tipo de carbapenemase após 20 horas de incubação. Seu procedimento é simples e os resultados podem ser facilmente interpretados. Basicamente, o método se baseia na exposição de um disco de meropenem (10µg) a uma suspensão bacteriana (uma alça de 1µL de crescimento bacteriano em 2mL de caldo tríptico de soja - TSB), seguido de incubação a 35 ± 2ºC por 4 horas ± 15 minutos (mCIM). Simultaneamente, uma placa de ágar Mueller-Hinton é inoculada com suspensão de E. coli ATCC 25922 com turbidez MF 0,5 e incubada a 35ºC por 4 horas. Um segundo tubo contendo 1,8 mL de TB e 0,2 mL de EDTA 0,5M e um terceiro tubo contendo 1,93 mL de TSB e 70 µL de solução de ácido fenil borônico (AFB) a 20 mg/mL em DMSO são inoculados da mesma forma que o primeiro e a cada um deles é adicionado 1 disco de 10 µg de meropenem. Os tubos são incubados a 35ºC por 4 horas. A seguir os discos são aplicados na placa previamente inoculada com E. coli ATCC 25922 e a placa é novamente incubada. O diâmetro dos halos de inibição eventualmente presentes é aferido após 4 e 16 horas de incubação. Diâmetros de halo ≤ 10 mm após 4 horas de incubação indicam presença de carbapenemase. Se o halo for > 10 mm a cepa analisada não é produtora de carbapenemase. Após a primeira leitura, a placa é reincubada e nova leitura realizada com total de incubação de 16 horas. Os halos eventualmente presentes são interpretados conforme a Tabela 2.²²

Tabela 2. Interpretação do teste mCIMplus para caracterização de carbapenemases ​​​​​​​
 

Fonte: Adaptado de Petit M, Caméléna F, Cointe A, Poncin T, Merimèche M, Bonacorsi S, Birgy A, Berçot B. Rapid Detection and Characterization of Carbapenemases n Enterobacterales with a New Modified Carbapenem Inactivation Method, mCIMplus. J Clin Microbiol. 2020 ;58(11):e01370-20.²²

Métodos acidimétricos (CarbaNP e Blue-Carba) - Estes ensaios permitem detectar a hidrólise do carbapenêmico por meio de uma reação de acidificação que é evidenciada com a alteração da cor vermelho (CarbaNP) ou azul (Blue-Carba) para o amarelo. Ambos apresentam um alto nível de sensibilidade e especificidade (> 90% cada) na detecção de carbapenemases das classes A (p.ex.: KPC) e B (p.ex.: NDM, VIM, IMP).¹³ No entanto, apresentam baixa sensibilidade para detecção das oxacilinases.¹⁴ 

Atualmente, existem versões comerciais destes testes, tornando-os mais práticos no cotidiano.¹⁵ Segundo Pires (2013)¹³, o Blue-Carba apresenta algumas vantagens devido a maior simplicidade no protocolo por possibilitar o uso das colônias, dispensando extração prévia. Também possui o custo bastante reduzido quando comparado com os outros testes e maior facilidade na interpretação dos resultados. 

Método dos discos combinados com inibidores de betalactamases - este teste é baseado na determinação do halo de sensibilidade com carbapenêmicos isoladamente e associados a substâncias inibidoras de enzimas. Trata-se de um teste de baixo custo e pode ser realizado in house ou adquirido comercialmente.⁸ 

Para tanto, deve-se preparar uma suspensão da ERC em questão e semear em ágar Mueller Hinton. Após a absorção do inóculo pelo ágar, aplicar os discos dos carbapenêmicos com e sem inibidores das enzimas, conforme as Orientações do EUCAST para a detecção de mecanismos de resistência e resistências específicas de importância clínica e/ou epidemiológica. Uma limitação importante deste método é não detectar corretamente a coexpressão de enzimas de classes A e B.^8,16

Imunoensaios (testes imunocromatográficos, lateral flow ou fluxo lateral) - são testes comerciais baseados na detecção de carbapenemases com auxílio de anticorpos monoclonais. Existem opções comerciais desses testes capazes de detectar as enzimas das classes A, B e D como: KPC, VIM, IMP, NDM e OXA-48 por exemplo. Trata-se de testes de execução simples, resultados rápidos (até 15 minutos) e fácil leitura¹⁷.  A limitação desses testes é não detectar algumas variantes de KPC resistentes à ceftazidima-avibactam. Em caso de negatividade do teste mCIMplus, Blue-Carba ou Carba-NP e resistência a ceftazidima-avibactam, deverá ser realizada PCR para bla_KPC. ²³

O teste é bastante simples, e realizado a partir de uma suspensão de colônias da bactéria em questão, diretamente na solução tampão (fornecida no kit). Em seguida, algumas gotas dessa suspensão devem ser transferidas para o cassete para que ocorra a migração na superfície do teste. O teste deve ser lido somente após uma linha vermelha aparecer na altura do controle do teste, respeitando o tempo determinado por cada fabricante. A detecção de uma linha vermelha na altura da carbapenemase indicada no dispositivo indica a presença dessa enzima na bactéria avaliada.¹⁷  

MALDI-TOF MS - a espectrometria de massas tem sido amplamente utilizada na identificação de microrganismos, o que já está bem estabelecido em vários laboratórios clínicos por todo o mundo. Entretanto, a utilização dessa ferramenta para avaliar a hidrólise de moléculas de antimicrobianos vem se desenvolvendo cada vez mais.¹⁸ A metodologia se baseia na detecção de produtos derivados da degradação do carbapenêmico, quando exposto a extratos proteicos do microrganismo testado.¹⁹

Alguns autores tem estudado a possibilidade de detectar futuramente o tipo de enzima baseado na espectrometria de massas. Essa ferramenta pode ser promissora, considerando a exigência mínima de consumíveis, entretanto, a utilização de softwares que interpretem automaticamente a atividade de hidrólise e o tipo de enzima pode ser necessária para aplicação nos laboratórios de análises clínicas no futuro.¹⁰

Em conclusão, o papel do laboratório de microbiologia clínica é fundamental para a detecção acurada e precoce da presença de carbapenemases em Enterobacterales, bem como a caracterização do tipo de enzima envolvida. Este é o primeiro passo para compreendermos melhor a epidemiologia das ERCs e consequentemente otimizar o diagnóstico, tratamento e prevenção da infecções por esses microrganismos multirresistentes.^5,10,12 

Referências
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