1. Importância da Cultura de Vigilância 
     
A colonização por bacilos Gram negativos resistentes aos carbapenêmicos (BGN-RC) é uma importante causa de infecção e uma das principais fontes de disseminação desses microrganismos nos sistemas de saúde e na comunidade^1,2.
    
Culturas de vigilância são destinadas à detecção de pacientes colonizados, ou seja, indivíduos geralmente assintomáticos portadores de microrganismos epidemiologicamente importantes³.

A transmissão cruzada de BGN-RC é dependente de dois fatores; (a) existência de “reservatórios”, pacientes colonizados e superfícies contaminadas no ambiente e (b) “uma via de transmissão” representada principalmente pelas mãos dos profissionais de saúde. A detecção de pacientes colonizados permite o estabelecimento de medidas de precaução de contato visando o controle da transmissão destes agentes presentes de forma silenciosa nestes indivíduos^4,5. Além disso, o transporte intestinal de genes de resistência alocados em elementos móveis, como plasmídeos e transposons, é uma importante fonte de transmissão interespécie e tanto Enterobacterales como BGN não fermentadores são capazes de servir como reservatórios e vetores⁴.

A colonização comumente é o primeiro passo para o desenvolvimento de uma infecção nosocomial. A identificação precoce de infecções evita o atraso da terapia antimicrobiana apropriada, preditor independente para mortalidade na sepse^6,7.  O percentual de desenvolvimento de infecções em pacientes previamente colonizados por K. pneumoniae resistente a carbapenêmico varia de 9% a 32,5%, com maior percentual em pacientes após transplante hematológico^8,9. Pacientes colonizados têm, em média, 1,79 vezes maior risco de morrer em terapia intensiva do que os pacientes não colonizados, principalmente ligados ao desenvolvimento de infecções e um aumento do tempo de permanência hospitalar ¹⁰.  
   
As infecções causadas por BGN-RC apresentam poucas opções terapêuticas e estão associadas a altas taxas de mortalidade^11,12. A resistência aos carbapenêmicos em Enterobacterales  ocorre por meio da produção de carbapenemases, ou uma combinação de produção de ESBLs e/ou AmpC com perda/deficiência de porinas, bombas de efluxo ou mutações em proteínas de ligação à penicilina (PBPs)^13,14. Destas, a  aquisição do gene de carbapenemase é a mais preocupante¹⁵, uma vez que ocorre mais frequentemente através da transferência de plasmídeos, que geralmente co-abrigam β-lactamases e outros determinantes de resistência, tornando essas cepas multirresistentes (MDR) ou extensivamente resistentes às drogas (XDR)¹⁶.    
 
Enterobacterales produtoras de carbapenemase (EPC) causam preocupação, nesse contexto, devido à resistência antimicrobiana de alto nível, disseminação clonal e transferência horizontal destes genes¹⁷.      
Carbapenemases incluem β-lactamases da classe A de Ambler (por exemplo, KPC e GES), classe B (MBLs, por exemplo, NDM, VIM, IMP e SPM) e classe D (por exemplo, OXA-48, OXA-181, OXA-23)¹³. 

O surgimento de resistência aos novos medicamentos, como foi observado com ceftazidima-avibactam torna a situação mais problemática18. Portanto, é crucial implementar medidas eficientes de controle de infecção para limitar a propagação desses patógenos.     

Pacientes colonizados têm a mesma importância epidemiológica dos clinicamente infectados e a vigilância ativa pode estimar melhor a pressão de colonização do que as culturas obtidas apenas a partir de amostras clínicas obtidas de pacientes infectados^19,20.      
                    

2. Metodologias convencionais de cultura de vigilância 

A detecção de carbapenemases a partir da cultura de vigilância tradicional é feita pela identificação do crescimento do BGN-RC. No entanto, métodos fenotípicos e imunocromatográficos também podem ser aplicados nesta abordagem. Dentre os métodos fenotípicos atualmente utilizados na prática clínica, encontram-se^21-43: 

O CIM, descrito pela primeira vez em 2015²¹, é baseado na hidrólise do meropenem (MEM) quando incubado com uma suspensão de um microrganismo produtor de carbapenemase. A sua descrição inicial relatou sensibilidade de 91 a 94% e especificidade de 99 a 100% para carbapenemases da classe A e para as carbapenemases do tipo OXA-48 e IMP a sensibilidade variou entre 50% a 91%^22,23. 

A partir desta publicação, variações desta metodologia foram descritas buscando melhorar a sensibilidade e especificidade frente às diferentes carbapenemases²⁴. 

Dentre elas, destacam-se o método de inativação do carbapenêmico modificado (mCIM), que modifica a primeira fase do teste, a inativação do carbapenêmico através do uso do caldo tríptico de soja (TSB), a extensão do tempo de incubação de 2 para 4 horas, apresentando para Enterobacterales sensibilidade de 99% e especificidade de 100%, e o aumento do inóculo bacteriano para P.aeruginosa (10 vezes) obtendo sensibilidade de 98% e especificidade de 95%²⁵. Posteriormente, foi descrito o eCIM realizando a técnica do mCIM acrescido de 20µl de 0,5M EDTA para detecção de carbapenemases da classe B em Enterobacterales. A interpretação do mCIM e do eCIM deve ocorrer no mesmo momento, pois o eCIM só deverá ser interpretado quando o mCIM for positivo, ou seja, isolado produtor de carbapenemase ²⁶. 

Estes testes requerem culturas com crescimento bacteriano puro, incubação overnight, não têm padronização para Acinetobacter baumannii, mas diferenciam classe A e B (se utilizado o eCIM) e apresentam-se como uma opção de baixo custo, acessíveis aos laboratórios de rotina²⁴.
     
(ii) Métodos baseados em inibidores que podem ser usados para diferenciar a classe das carbapenemases; por exemplo EDTA, ácido dipicolínico (ADP), ácido fenilborônico (AFB), cloxacilina (CLOXA)²⁷
     
Esses testes são baseados no uso de inibidores de β-lactamases e exibem especificidade em seu efeito hidrolítico, permitindo a caracterização da enzima em relação a sua classe, ao comparar a atividade de um disco de carbapenêmico na presença, e ausência do inibidor²⁷.

Testes baseados em inibidores desenvolvidos para a detecção específica de produtores de MβL exploram a sua dependência aos íons de zinco e usam agentes quelantes como EDTA e ácido dipicolínico (ADP), associado a um carbapenêmico (imipenem e/ou meropenem) e/ou uma oximino-cefalosporina (ceftazidima) como compostos β-lactâmicos indicadores ^28-30. 

Uma nota técnica da ANVISA (2013)³¹ recomenda o uso de 10 µl de EDTA 0,1M associado ao disco de carbapenêmico para Enterobacterales. Um teste é considerado positivo quando há um aumento do halo ou zona de inibição ≥ 5 mm quando comparado ao carbapenêmico sem o EDTA. 

Compostos de ácido borônico têm sido usados como inibidores para a detecção e caracterização de carbapenemases da classe A, principalmente KPC ^27,31. As enzimas KPC são inibidas pelo AFB, mas não ocorre potenciação quando é adicionada a cloxacilina. Os hiperprodutores de AmpC com alteração ou perdas de porinas são inibidos pelo AFB, mas ocorre potenciação quando é adicionada a cloxacilina (CLOXA), considerando um aumento ≥5 mm da zona de inibição quando comparado ao carbapenêmico sem os inibidores ²⁷. 

Até o momento, não existem inibidores disponíveis para as enzimas OXA-48-like. Alto nível de resistência à temocilina (CIM > 128 mg/L) tem sido proposto como um marcador fenotípico. No entanto, este marcador não é específico para carbapenemases do tipo OXA-48, uma vez que outros mecanismos de resistência podem conferir este fenótipo. A presença de enzimas OXA-48-like, portanto, deve ser confirmada com um método genotípico³² 

Estes testes requerem culturas com crescimento bacteriano puro, incubação overnight, diferenciam classe A e B, apresentam baixo custo e sensibilidade variável de acordo com o tipo de carbapenemase e o microrganismo, com baixa acurácia para P.aeruginosa e A. baumannii^27-32.     
     
(iii) Métodos de hidrólise que detectam produtos de degradação dos carbapenêmicos; por exemplo, Carba NP, Blue Carba, Carbapenembac® (PROBAC do Brasil, São Paulo, Brasil).
     
O teste de Carba NP (Carbapenemase Nordmann-Poirel) e o Blue Carba são testes colorimétricos baseados na detecção da hidrólise do carbapenêmico que resulta em um derivado carboxílico, que por sua vez diminui o pH produzindo mudança de cor ocasionada pela produção de carbapenemase³³. 

O Carba NP consiste em lise celular seguida de incubação do lisado enzimático com imipenem e vermelho fenol por até 2 horas, onde a positividade é observada pela mudança da coloração avermelhada para laranja ou amarelo ³³.

Modificações do Carba NP foram descritas aumentando a sensibilidade (84% a 99%) e a especificidade (em torno de 100%) para Enterobacterales e P.aeruginosa 36. O uso em Acinetobacter spp. exige algumas modificações nas condições de lise e inóculo bacteriano para melhorar a acurácia diagnóstica^34-37. 

O Blue Carba, é uma metodologia semelhante, mas com protocolo mais simplificado, utiliza o indicador de pH azul de bromotimol 34. O teste possui uma maior sensibilidade, inclusive para as carbapenemases de tipo OXA e um tempo de resposta mais rápido do que o Carba NP. A positividade é evidenciada pela mudança de cor, que poderá variar de amarelo a esverdeado. O Blue Carba demonstrou 100% de sensibilidade e especificidade para detecção de carbapenemases em Enterobacterales, P.aeruginosa e A.baumannii ^35,36.

Estes testes requerem culturas com crescimento bacteriano puro, incubação de 30 a 120 min, apresentam baixo custo, sobretudo quando os reagentes são preparados in house, com boa acurácia para Enterobacterales, P.aeruginosa e A.baumannii^33-36.

O teste de Carbapenembac® (PROBAC, São Paulo, Brasil) é baseado na detecção da hidrólise do carbapenêmico ocasionada pela produção de carbapenemase. A diminuição do  pH produz mudança de cor em uma solução de iodo especial. Entre 15 a 30 minutos a cor escura do iodo torna-se clara (amarela esbranquiçada) na borda da tira, indicando teste positivo e a presença de atividade de carbapenemase. A hidrólise será evidenciada até sumir quase totalmente a cor preto/roxo, ficando apenas a amarela. Este tempo pode variar de 15 a 90 minutos após a colocação da Solução de iodo especial ³⁷.

Para diferenciar entre as enzimas da classe A e B, pode-se utilizar as fitas Carbapenembac Metalo® (PROBAC do Brasil, São Paulo, Brasil) na qual a suspensão bacteriana é feita na solução seletiva contendo EDTA (PROBAC, São Paulo, Brasil). Esta substância bloqueia os íons Zinco das metalo-β-lactamases, tornando-a inerte, impedindo a formação de subprodutos da degradação, fazendo com que a prova com as fitas não seja mais positiva. Neste caso, se a fita permanece escura é porque a prova é positiva para MβL ^38-39.

Estes testes não necessitam de incubação para extração, os resultados são obtidos em 15 a 90 minutos, com baixo custo, e permitem a discriminação das classes A e B ao utilizar o Carbapenembac Metalo®^33-39. 
 
   
Ensaios imunocromatográficos de fluxo lateral 
     
Os métodos imunocromatográficos de fluxo lateral (ICT) são métodos baseados em anticorpos para identificar a presença de carbapenemases⁴⁰. Eles permitem a detecção das principais carbapenemases como KPC, NDM, IMP, OXA-48-like e VIM⁴⁰. O teste é baseado na utilização de nanopartículas de ouro coloidais ligadas à membrana de nitrocelulose sensibilizada com anticorpos monoclonais. A detecção é feita a partir de isolado bacteriano dentro de 15 minutos da migração com base na presença de linhas visíveis indicando um teste positivo ⁴¹.

Os ensaios de ICT produzem resultados com sensibilidade de 99% a 100% e especificidade de 95% a 99,7% ^43-46. 

É importante ressaltar que estes ensaios foram capazes de detectar com precisão e rapidez isolados que produzem duas ou mais carbapenemases, sendo de fácil execução. O seu custo, no entanto, ainda é elevado^40-43.     
     

3. Metodologias moleculares aplicadas à vigilância de carbapenemases      
                                        
Ensaios genotípicos automatizados que utilizam a tecnologia de PCR multiplex, microarray ou amplificação isotérmica realizados a partir do swab retal vêm sendo incorporados às rotinas laboratoriais para o rastreamento de colonização por patógenos que carregam genes de carbapenemases. O método traz vantagens como agilidade e facilidade na execução, tempo reduzido de “turnaround” (TAT), alta sensibilidade e especificidade, além da identificação do tipo de carbapenemase ^44,45. 

Estas plataformas são projetadas para executar ensaios específicos, onde o usuário tem capacidade limitada para modificar o ensaio e a interpretação do resultado. São conhecidas como plataformas “sample-to-result”, onde a extração, amplificação e análise de ácidos nucléicos acontecem dentro do equipamento^46,47. Dentre estas plataformas existem:
  

• GeneXpert® (Cepheid, Sunnyvale, CA)⁴⁶;      
• BD Max® (BD, Sparks, MD)⁴⁷.      

As principais características destas plataformas, incluindo alvos de detecção aprovados pelo FDA e tempo de resposta, estão relacionados na Tabela 1.    
 
Tabela 1. Plataformas moleculares automatizadas^46,47    

 

Tabela elaborada pelo autor.

4. Conclusão

A escolha do método para detecção de colonização depende dos patógenos mais prevalentes, das estratégias do serviço de controle de infecção hospitalar, estrutura do laboratório de microbiologia e recursos alocados para monitoramento^4,5.

Métodos fenotípicos realizados a partir da cultura de vigilância, de um modo geral, apresentam limitações como: desempenho variável conforme o tipo e expressão da enzima, subjetividade de interpretação a depender da hidrólise enzimática e um elevado TAT, trazendo prejuízo às práticas de controle de infecção⁴⁸. Dentre as vantagens encontram-se a acessibilidade, simplicidade, baixo custo e detecção de resistências emergentes.

Métodos genotípicos realizados a partir do swab retal são de simples execução, com baixa carga de trabalho, adaptado para o laboratório de rotina onde os resultados da PCR são interpretados no software, minimizando a subjetividade de interpretação. Além disso, os resultados podem ser salvos eletronicamente, facilitando a auditoria e revisão⁴⁹. O método permite conhecer a epidemiologia local, sendo útil para adequar a terapia antimicrobiana, e permitindo a detecção precoce de surtos. Os resultados são substancialmente mais rápidos do que a cultura. Dentre as desvantagens, destacam-se a não detecção de carbapenemases que não estão incluídas entre os alvos e o custo elevado. No entanto, a melhoria dos procedimentos de controle de infecções poderia reduzir significativamente os custos com a saúde, limitando o aparecimento de grandes surtos hospitalares⁴⁹.

Como parte dos esforços para prevenção de ERC, alguns países exigem que estes isolados sejam submetidos à determinação do gene de carbapenemase, não confiando apenas na determinação fenotípica. O CDC americano incentiva, mas não exige, que os laboratórios rastreiem a presença de carbapenemases específicas como KPC, NDM e OXA-48 ⁵⁰. 


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